13 ผลงานวิจัยดีเด่นกรมวิชาการเกษตรในงานประชุมวิชาการปี 2563 เรื่องที่2 อินทผลัม

ผลงานวิจัยดีเด่นกรมวิชาการเกษตรในงานประชุมวิชาการปี 2563

เรื่องที่2
การใช้เทคนิคเลเทอรัลโฟลว์อิมมูโนโครมาโตกราฟฟิกสตริปส์ ตรวจดีเอ็นเอแยกเพศอินทผลัมแบบรวดเร็ว
โดย อรุโณทัย ซาววา ศิริลักษณ์ อินทะวงศ์ จารุฉัตร เขนยทิพย์ ประสาน สืบสุข มัลลิกา แก้ววิเศษ นุชนารถ ตั้งจิตสมคิด
ขนิษฐา วงศ์วัฒนารัตน์ ปิยรัตน์ ธรรมกิจวัฒน์ ดนัย นาคประเสริฐ

อินทผลัม (Date palm) มีชื่อวิทยาศาสตร์คือ Phoenix dactylifera L. เป็นพืชไม่สมบูรณ์เพศ(dioecious plant) อยู่ในตระกูล Arecaceae มีถิ่นกำเนิดในแถบตะวันออกกลาง สามารถเจริญเติบโตได้ดีในภูมิภาคที่มีอากาศร้อน (Wellmann et al., 2007) ประเทศอียิปต์เป็นประเทศที่ปลูกอินทผลัมมากที่สุด รองลงมาได้แก่ อิหร่าน แอลจีเรีย ซาอุดิอาระเบีย (FAO, 2017) ประเทศไทยนิยมปลูกอินทผลัมในภาคเหนือ ตะวันออกเฉียงเหนือ และภาคตะวันตก ตามลำดับ การเพาะเมล็ดมีโอกาสเป็นต้นตัวผู้และต้นตัวเมียมีอย่างละครึ่ง ต้องรอจนกว่าจะออกดอก 3-7 ปีจึงจะทราบเพศ

การแยกเพศอินทผลัมด้วยวิธีพีซีอาร์(PCR: Polymerase Chain Reaction) มีรายงานจากต่างประเทศสามารถใช้เทคนิค ได้แก่ PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
SSR (Simple Sequence Repeat) แ ล ะ SCAR (Sequence Characterized Amplified Region)(Cherif et.al., 2012; Elmeer and Mattat, 2012) โดยเทคนิค PCR-RFLP และ SCAR มีใช้จ่ายน้อยกว่าการตรวจสอบด้วยเทคนิค SSR ที่ต้องใช้อุปกรณ์เครื่องมือแยกขนาดชิ้นส่วนพีซีอาร์ที่มีราคาสูง (Al-Mahmoud et al., 2012)

สำหรับประเทศไทยมีรายงานการแยกเพศอินทผลัมในระยะต้นกล้าด้วยเทคนิคพีซีอาร์ด้วยไพรเมอร์แบบผสม ผลผลิตพีซีอาร์ที่ได้ปรากฏแถบดีเอ็นเอในอินทผลัมต้นตัวผู้ 2 แถบ ขนาด 320 และ 430 คู่เบส และในต้นตัวเมีย 1 แถบ ขนาด 430 คู่เบส (นพรัตน์ และคณะ, 2558) แต่การตรวจสอบแถบดีเอ็นเอที่ได้จากวิธีพีซีอาร์แบบไพรเมอร์ผสมจ านวน 2 คู่ไพรเมอร์ มักประสบปัญหาความคมชัดและแถบดีเอ็นเอที่ไม่ต้องการเมื่ออ่านผลบนบนเจลอะกาโรส (agarose gel) อาจทำให้การอ่านผลเกิดความผิดพลาดได้ง่าย จึงจำเป็นต้องอาศัยผู้ชำนาญและมีความเชี่ยวชาญในการดำเนินงานและตรวจสอบผล

ปัจจุบันหลักการเลเทอรัลโฟลว์ (Lateral flow) ที่พัฒนาโดย Singer และ Plotz มีการจำหน่ายในเชิงพาณิชย์แล้วตั้งแต่ปี1984 ได้ถูกนำมาพัฒนาเป็นเทคนิคเลเทอรัลโฟลว์อิมมูโนกราฟฟิ กสตริปส์ (LFICS: Lateral Flow Immunochromatographic Strips) การตรวจสอบดีเอ็นเอจากผลผลิตพีซีอาร์อย่างง่ายและรวดเร็ว โดยการนำฉลากสีที่มีแอนติบอดี(antibody) ในการจับ มาติดทางด้านปลาย 5’ ของสายไพรเมอร์เมื่อนำไพรเมอร์ที่ติดฉลากสีแล้วมาเพิ่มปริมาณดี
เอ็นเอด้วยวิธีพีซีอาร์ สามารถนำไปอ่านผลบนแผ่นสตริปส์ภายในระยะเวลา 3-5 นาที ใช้ผลผลิตพีซีอาร์ในปริมาณน้อย ผลการตรวจสอบแถบดีเอ็นเอมีความละเอียดแม่นยำสูง ง่ายต่อการใช้งาน รวดเร็ว ราคาถูก และสามารถลดการใช้อุปกรณ์เครื่องมือในการตรวจสอบได้หลายขั้นตอน (Jauset-Rubio et. al., 2016; Pecchia and Lio, 2018; Zhuang et.al., 2019)

การทดลองนี้จึงมีวัตถุประสงค์เพื่อศึกษาเครื่องหมายดีเอ็นเอที่เฉพาะเจาะจงกับเพศอินทผลัม และใช้เทคนิค LFICS ตรวจแยกเพศอินทผลัมแบบรวดเร็วตั้งแต่ระยะกล้า เพื่อให้ง่ายต่อการใช้งาน และสามารถนำไปต่อยอดพัฒนาเป็นชุดตรวจสอบภาคสนามได้

การวิจัยนี้จึงมีวัตถุประสงค์เพื่อใช้เทคนิคเลเทอรัลโฟลว์อิมมูโนโครมาโตกราฟฟิกสตริปส์
(LFICS: Lateral Flow Immunochromatographic Strips) ในการตรวจดีเอ็นเอแยกเพศอินทผลัมอย่างรวดเร็ว โดยทำการทดสอบไพรเมอร์ด้วยวิธีพีซีอาร์ พบคู่ไพรเมอร์ DpDOAmale5F และ
DpDOAmale5R มีความเฉพาะเจาะจงต่ออินทผลัมเพศผู้ เมื่อใช้ร่วมกับคู่ไพรเมอร์ PDK30sF และ PDK30sR จะปรากฏแถบดีเอ็นเอเฉพาะในต้นตัวผู้ขนาด 450 คู่เบส และแถบดีเอ็นเออ้างอิงขนาด 693 คู่เบส การทดสอบคู่ไพรเมอร์กับอินทผลัมพันธุ์โกหลักและบาฮีที่ทราบเพศแล้วจำนวน 120 ต้น พบมีความจำเพาะต่อเพศ 100 เปอร์เซ็นต์ จากนั้นนำคู่ไพรเมอร์ดังกล่าวติดฉลากสีด้วยสาร Fluorescein isothiocyanate (FITC) แล ะ Digoxigenin (DIG) เพื่อใช้ทำปฏิ กิริยาพี ซีอาร์และตรวจสอบดีเอ็นเอด้วยชุด LFICS พบว่าสามารถตรวจสอบแถบดีเอ็นเอได้ทั้งจากวิธีพีซีอาร์และไดเรกซ์พีซีอาร์ โดยใช้ผลผลิตพีซีอาร์ปริมาตร 1.25-5 ไมโครลิตร เมื่อเปรียบเทียบขั้นตอนการตรวจดีเอ็นเอ 3 วิธี ได้แก่ พีซีอาร์ พีซีอาร์ร่วมกับ LFICS และไดเรกซ์พีซีอาร์ร่วมกับ LFICS พบว่าวิธีไดเรกซ์พีซีอาร์ร่วมกับ LFICS สามารถทราบผลภายใน 1ชั่วโมง จากวิธีพีซีอาร์เดิมทราบผลภายใน 10 ชั่วโมง นอกจากนี้ชุด LFICS มีความแม่นยำสูง ง่ายต่อการใช้งาน ลดการใช้สารเคมีอันตราย และลดการใช้อุปกรณ์ในห้องปฏิบัติการ ซึ่งสามารถนำไปต่อยอดเพื่อพัฒนาเป็นชุดตรวจสอบเครื่องหมายดีเอ็นเอแบบภาคสนามได้

…..
อ่านเรื่องเต็มจากผลงานวิจัยดีเด่นกรมวิชาการเกษตร ปี 2562

ใส่ความเห็น

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out /  เปลี่ยนแปลง )

Google photo

You are commenting using your Google account. Log Out /  เปลี่ยนแปลง )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out /  เปลี่ยนแปลง )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out /  เปลี่ยนแปลง )

Connecting to %s